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    色譜全能冠軍——聚合物色譜層析介質

    瀏覽次數: 日期:2020-03-23 15:09:03

    導讀
      硅膠色譜填料因具有良好的機械強度、耐溶劑性、可控的比表面積和孔徑大小、不溶脹和不可壓縮性、且表面富含易于鍵合或改性的硅羥基等優點,使得硅膠成為實驗室分析檢測及中小分子工業分離純化最主要填料。而天然碳水高分子改性介質(軟膠)由于親水強,生物兼容性好,能減少對生物分子的非特異性吸附等特點,因此在分離過程中容易保持生物分子的生物活性而被廣泛地用于生物大分子的分離純化過程中,也是生物大分子分離純化應用歷史最悠久,應用最多的層析介質。硅膠填料和軟膠介質具有各顯鮮明的特點,因此其色譜適用領域各不相同,前者主要用于中小分子的分離純化,而后者往往用于生物大分子的分離純化。聚合物色譜層析介質發展較晚,但由于其卓越的機械性能和極強的化學穩定性,既避免了硅膠固有不耐酸堿的缺陷,也克服了軟膠機械強度差的問題,因此聚合物介質是個全能型的色譜層析介質,即可以替代硅膠作為反相色譜填料用于中小分子分離純化,也可以替換軟膠介質用于生物大分子的層析分離。本文介紹了聚合物色譜層析材料技術的發展歷程和未來的發展方向。

    簡介           
      液相色譜和層析技術已有上百年發展歷史,色譜和層析是從Chromatography翻譯過來的。通常用于小分子分離純化和分析檢測的Chromatography習慣叫色譜,而用于生物大分子分離純化的Chromatography叫層析。色譜和層析技術可以對復雜混合組份進行有效分離而且條件溫和,適用性廣,已成為工業分離純化和實驗室分析檢查最重要的工具。色譜和層析已廣泛地用于核工業,化工,食品,和醫藥領域,既可以用于無機貴金屬的分離富集,也可以用于有機合成藥物的分離純化,還可以用于復雜天然產物提取分離,甚至可以對物理和化學性能幾乎完全一致但空間結構不同的手性分子進行拆分;更是生物分子的分離純化主要甚至是唯一手段。無論抗生素、多肽、胰島素,還是抗體、病毒、疫苗等各種結構復雜的生物分子分離純化都離不開色譜和層析技術。常用小分子分離模式主要有正相色譜、反相色譜、Hilic、和手性色譜;常用生物大分子分離模式的主要有分子篩(凝膠過濾)、疏水、離子交換、親和層析及混合層析等。
     

    1.新型分離材料的出現促進色譜分離技術的進步
      色譜填料和層析介質是整個色譜和層析分離技術的核心,不同功能化的色譜填料和層析介質是液相色譜和層析廣泛應用的基礎。色譜或層析分離效果很大程度上取決于色譜填料和層析介質;色譜和層析技術重大進步往往是隨著新的分離材料的出現而發展的:小粒徑球形多孔硅膠的出現促進了色譜分離分析的快速發展,使得高效液相色譜技術HPLC 成為分析領域應用最廣,最有效的檢測和分離手段;而亞2 μm的硅膠填料的發展使得超高壓UPLC出現成為可能,也使得HPLC的分辨率,檢測速度及柱效達到前所未有的水平;多孔核殼色譜填料的出現讓普通的HPLC色譜儀器上獲得UPLC 的分離速度和效果;手性色譜填料的發展使光學異構體拆分和檢測變得更加容易,也促進了手性藥物的快速發展;聚苯乙烯高分子色譜填料的發展使得分析分離可在全pH 范圍內進行。親水性色譜填料(HILIC)的發展使得強極性的物質得到更有效的分析和分離;碳水高分子介質的出現不僅可以有效地分離純化生物大分子而且在分離的過程中能保持生物的活性,促進生物技術產業發展;金屬螯合親和填料的發展使得帶有His-Tag 的蛋白分子可以得到快速簡便的分離;Protein A 親和填料的出現極大簡化了抗體藥物的分離純化,使得Protein A 親和層析成為抗體分離純化的金標準。高性能新型色譜填料及層析介質的不斷出現是液相色譜和層析分離和分析技術發展的有效驅動力,也是色譜和層析研究中最豐富、最富有活力、最具有創造性的研究方向之一。

    2.主要色譜填料的種類及其特點
      色譜分離材料主要有三大類:第一類是以多孔二氧化硅(硅膠)為代表的無機化合物色譜填料;第二類是以瓊脂糖、葡聚糖為代表的改性碳水高分子層析介質(軟膠);第三類是以交聯聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯為代表的合成高分子聚合物色譜填料和層析介質,其中硅膠,聚苯乙烯,聚丙烯酸酯和多糖基軟膠介質是市場上最常用色譜填料和層析介質。


      硅膠色譜填料——小分子分離純化和分析檢測首選填料
      硅膠及鍵合硅膠色譜填料因具有良好的機械強度、耐溶劑性、可控的比表面積和孔徑大小、不溶脹和不可壓縮性、及表面富含易于鍵合或改性的硅羥基等優點,使得硅膠成為高效色譜填料應用歷史最悠久、最廣泛的高效液相色譜填料之一,成為實驗室分析色譜及小分子工業分離純化主要介質。但硅膠在酸堿條件下不穩定的缺點使其不適合用于在堿性條件下分離。因此硅膠很少用于生物大分子的分離純化。

      多糖基軟膠層析介質——生物大分子分離純化的開拓者
      天然碳水高分子(主要是瓊脂糖和葡聚糖)改性填料由于具有親水強,生物兼容性好,能減少對生物分子的非特異性吸附等特點,因此在分離過程中容易保持生物分子的生物活性而被廣泛地用于生物大分子的分離純化過程中,也是生物大分子分離純化應用歷史最悠久,應用最多的層析介質。但天然碳水改性高分子介質因其基質柔軟,導致機械強度差、溶脹體積大、流速慢等缺點,因此被稱為軟膠;另外由于糖基介質是在溶脹狀態下產生的網狀孔隙結構,空阻大,大分子在這種介質的傳遞速度慢,在高流速條件下載量低,因此極大地限制了生物分離純化的生產效率。

     



    3.聚合物色譜填料——后來居上的色譜全能冠軍
      硅膠填料和多糖基軟膠介質具有各自鮮明的特點,因此其適用范圍各不相同,前者主要用于中小分子的分離純化,而后者往往用于生物大分子的分離純化。聚合物剛好是介于硅膠和軟膠之間,即可以作為反相色譜填料替換硅膠用于中小分子分離純化,也可以替換軟膠介質用于生物大分子的層析分離。通過控制聚合物微球材料組成,孔道結構及表面修飾和功能化可以形成離子交換、疏水、親和等不同分離模式的色譜填料和層析介質。聚合物填料基質主要包括聚苯乙烯,聚丙烯酸酯及聚丙烯酰胺等。多孔聚苯乙烯微球由于本身帶有苯基疏水功能基團,表面不需要鍵合烷基鏈等疏水基團就可以直接作為反相色譜填料,其最大的優點是具有極強的化學穩定性、耐熱性能和耐酸堿性能,并可在pH=1-14全范圍工作,因此聚苯乙烯色譜填料使用壽命是目前所有色譜填料和層析介質中最長的,也是耐臟性能最好的,它可以通過強酸強堿溶液及有機溶劑在線清洗,以達到填料再生的目的,有利于藥品純化的穩定性和重復性。另外聚苯乙烯色譜填料的孔徑可調且孔徑范圍選擇比較大,孔徑小到5納米,大到400納米的色譜填料都有商業化產品,因此可以滿足從有機化合物小分子到多肽胰島素再到抗體疫苗等生物大分子各種分離純化的需求。
      聚苯乙烯色譜填料機械強度及耐壓性雖然低于硅膠,但近期開發的高度交聯的單分散聚苯乙烯色譜填料可耐受60公斤以上壓力,完全可以滿足高壓制備色譜的要求,而且其柱效可以與與硅膠柱相媲美,如10微米聚苯乙烯色譜填料裝到1米直徑的DAC制備柱中,其柱效可高達45000塔板數每米以上。因此聚合物色譜填料柱效不如硅膠其實是個誤區。柱效往往與填料顆粒大小和分布有關,與材質沒有什么關系。以前聚合物色譜填料柱效普遍差于硅膠色譜填料原因主要是聚合物色譜填料密度較小,篩分較困難,因此生成的聚苯乙烯色譜填料粒徑分布比較寬導致柱效低。而種子法可以制備粒徑精確可控,分布均一的單分散聚合物色譜填料,因此其柱效和分辨率可以大幅度提高。當然聚苯乙烯色譜填料的也有其缺陷。其主要問題就是在有機溶劑中會溶脹,而且不同溶劑溶脹比例不同,因此會影響其柱床的穩定性。采用動態壓縮柱(DAC)會明顯改善其柱床穩定性,提高柱效,使得聚合物色譜填料越來越多用于高效分離純化。另外聚苯乙烯色譜填料的孔徑分布一般比硅膠寬,造成聚苯乙烯反相色譜填料的分辨率往往低于硅膠色譜填料,但聚苯乙烯色譜填料的色譜分離選擇性與硅膠具有一定的互補性,首先聚苯乙烯色譜填料沒有硅膠表面的硅羥基,避免了強極性和堿性物質的非特異吸附, 也改善了填料的分離效能, 即使是在中性條件下分析堿性物質, 仍能保持完美峰型。另外聚苯乙烯色譜填料可以做成超大孔貫流色譜填料。其孔徑結構由貫穿孔(200 ~ 800 nm)和擴散孔(10 ~ 100 nm)組成。與僅有擴散傳質的傳統小孔徑填料相比,分子的傳質速率大大提高, 從而使分離速度加快。超大孔聚合物色譜填料尤其適合生物大分子的分離純化。由于聚合物色譜填料極強的耐酸堿性,極長的使用壽命,使其越來越多地用于抗生素,多肽,胰島素,天然產物的大規模分離純化。
      除了聚苯乙烯外,聚丙烯酸酯及聚乙烯吡咯也可以作為反相色譜填料,因其含有極性功能基團,其疏水性能弱于聚苯乙烯色譜填料,使得這些材料具有一些獨特的分離選擇性,有利于分離強疏水的樣品。
      聚苯乙烯或聚丙烯酸酯微球除了可以直接用作反相色譜填料外,還可以通過表面親水化改性及功能化制備離子交換,疏水,分子篩及親和層析介質以滿足各種生物大分子分離純化的需求。與軟膠相比,聚合物為基質的層析介質最大的優點是其高機械強度,因此可以耐受高柱壓、高流速、及較高粘度的樣品,意味著在更短的時間處理更大體積的物料,縮短循環周期,提高單位時間的產量,并可以使用直徑更小的層析柱。另外聚合物微球粒徑大小、粒徑分布更容易控制,使得聚合物填料更容易裝柱,柱效和分辨率也更高。同時聚合物具有孔徑大、滲透性好、分子傳質速度快等優點。相反,軟膠基球為網狀孔道結構、孔徑小、比表面積高,但其傳質阻力大,因此軟膠在低流速下往往比聚合物介質具有更高載量,但在高流速條件下,聚合物層析介質反而比軟膠具有更高載量。聚合物層析介質的缺點是其疏水往往比軟膠強,非特異性吸附大。因此聚合物微球表面往往需要進行親水化改性以降低其非特異性吸附。



    4.國內外聚合物全能色譜填料發展狀況



      傳統聚合物色譜填料微球是通過懸浮聚合制備的。該方法是以水溶液為介質,把油溶性的單體和致孔劑混合液通過攪拌分散成細小的液滴,加熱引發單體液滴聚合變成固體聚合物微球,然后清洗去除致孔劑,最后經過篩分分級工藝形成聚合物色譜填料。懸浮聚合法工藝簡單、操作方便、有利于大規模生產,但這種方法制得的微球粒徑成高斯(Gaussin)分布、粒徑分布很寬,必須經過復雜分級篩分工藝去除過大和過小的微球才能滿足色譜填料的需求。粒徑越小篩分工藝越復雜,難度越大,即使經過復雜篩分工藝的填料其粒徑仍然不夠均勻。聚合物色譜填料粒徑分布是影響其色譜性能最重要的參數之一。粒徑分布越均勻,柱效越高,分辨率越高,柱壓越低。因此直接制備粒徑精確可控且高度均勻的聚合物色譜填料以避免復雜的篩分工藝一直是業界追求的目標。



      1983年挪威科學家Ugelstand研究組發明了兩步或多步種子聚合法制備了5-30微米范圍內的單分散聚合物多孔微球(US Patent No.4530956)。該方法是利用單分散可溶脹聚合物微球為種子,通過種子吸附非水溶性的活化劑比如鄰苯二甲酸二丁酯進行活化?;罨哪康氖菫榱朔N子可以吸附更多的有機單體。種子在吸收了單體、致孔劑及活化劑后形成更大粒徑的液滴后,通過加溫聚合即可得到更大尺寸的單分散聚合物微球。Ugelstad開發的技術被Dynal公司成功地用于生產單分散聚合物色譜產品,讓Dynal成為世界上提供均勻聚合物微球技術和產品的引領者,而且很長一段時間內是獨霸天下。美國GE公司推出的一系列SOURCE單分散性聚苯乙烯色譜填料就是Dynal公司生產的。這種單分散聚合物色譜填料極大地改善了聚合物色譜分離和分析性能,使其分辨率,柱效,分離效果可以與市場上的反相硅膠相媲美,同時又克服了反相硅膠使用壽命短, 耐酸堿性差等缺陷。
      Ugelstad的多步種子聚合技術開創了單分散聚合物色譜填料制備技術先河,但Ugelstad 種子法技術也存在一些局限性:主要是生產工藝復雜,生產周期長,成本高,制備的微球粒徑及孔徑控制都有一定的局限性。因此SOURCE 填料最大的粒徑是30微米,而且孔徑只有100 納米一種規格。SOURCE粒徑和孔徑規格受限且其價格昂貴,嚴重影響其在分離純化的廣泛使用。很遺憾,SOURCE 單分散聚合物色譜填料在上世紀八十年代就已經開發出來,但過去幾十年來,Dynal 和 GE 在單分散聚合物色譜填料制備技術及產品拓展方面并沒有更大突破和進展,世界上也沒有其它公司在單分散聚合物色譜填料的制備技術上可以超越Dynal和GE。目前SOURCE 單分散聚合物色譜填料由于粒徑和孔徑的局限性,它即不能滿足抗生素,天然產物等小分子分離純化需要孔徑小,比表面積大,粒徑大且價格便宜的要求,也不能滿足蛋白和抗體類生物大分子分離純化需要大孔徑和大粒徑以滿足低壓層析的工藝要需。
      



      為了突破現有單分散聚合物色譜填料的粒徑和孔徑控制的局限性,納微的技術團隊經過十多年努力開發出創新性邊溶脹邊聚合種子法制備單分散的聚合物微球(發明專利CN200710124981.0)。該方法克服了Ugelstad 多步溶脹法的局限性:首先該方法不需要多步溶脹工藝,大大簡化生產流程,縮短生產周期使得納微可以高效率、低成本、大規模生產出單分散聚合物色譜填料;另外該方法突破Ugelstad種子法的很難做大粒徑聚合物微球的局限性,使得納微可以生產更大尺寸、更多孔徑規格、及更多材質組成的的單分散聚合物色譜填料。納微單分散聚合物色譜填料和層析介質產品規格已遠超過SOURCE 產品,成為全球單分散聚合物色譜填料技術和產品的領導者。相比于Dynal 生產的SOURCE單分散聚合物色譜填料(只有一種聚苯乙烯基材,一種孔徑規格,且最大粒徑不超過30微米),納微可提供100, 300, 500, 700,1000,2000,4000 A等多種孔徑規格選擇,及更多粒徑規格(3,5, 10,15, 30, 40,50,80微米)單分散聚合物色譜填料。而且擁有聚苯乙烯、聚丙烯酸酯及聚乙烯吡咯烷酮三大系列材質組成的單分散色譜填料。納微提供更多種類和規格的單分散色譜填料極大拓廣了其分離純化的應用領域,不僅可以用于有機化藥、抗生素、植物藥、多肽、胰島素等中小分子的分離純化,而且可以用于蛋白、抗體、核酸、疫苗等大分子的分離純化,讓聚合物色譜填料真正成為色譜填料的全能冠軍。

     



      納微創新性單分散聚合物微球精準制造技術平臺,可以對微球的粒徑大小,粒徑分布,孔徑結構,材質組成及表面性能達到前所未有的控制水平,極大地推動了單分散色譜填料和層析介質制造技術的進步,拓寬了單分散聚合物色譜填料和層析介質的種類和規格的選擇范圍,拓寬了其在抗生素、多肽、胰島素、蛋白、抗體、疫苗、天然產物及有機合成藥物分離純化的應用。納微作為一家創新型公司不僅填補了國內聚合物色譜填料及產品的空白而且推動了世界色譜填料精準制造技術的進步,也促進聚合物色譜填料在藥物分離純化的廣泛使用,使得聚合物色譜填料真正成為色譜全能冠軍。另外,納微還突破了單分散硅膠色譜填料精準制備技術這一世界難題,顛覆現有球形硅膠的制備方法,成為全球首個實現大規模生產粒徑高度均一的單分散硅膠色譜填料的公司。納微也是全球唯一可以同時大規模生產單分散聚合物和硅膠色譜填料的公司??梢灶A期,粒徑、孔徑可精確控制的單分散色譜填料和層析介質將替代多分散填料成為分離純化應用主流的填料是必然的趨勢。

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